前言：采用分光光度法監(jiān)控反應(yīng)底物的減少或反應(yīng)產(chǎn)物的增加，可以跟蹤對-硝基苯基乙酸酯 (pNPA) 的水解反應(yīng)過程。監(jiān)控濃度變化的速率可以確定反應(yīng)的速率。Agilent Cary 8454 紫外-可見二極管陣列分光光度計(jì)只需 0.1 秒的時(shí)間就能夠獲得全光譜。您可以根據(jù)需要隨時(shí)從儲存的光譜數(shù)據(jù)中提取出隨時(shí)間變化的吸光度。由于包含整個(gè)波長范圍的數(shù)據(jù)是在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)里同時(shí)獲得的，因此，可以對不同波長的結(jié)果進(jìn)行準(zhǔn)確的闡釋，為反應(yīng)機(jī)理的研究提供有用的信息。

采用傳統(tǒng)的掃描分光光度計(jì)，通常能夠比較方便地在單一波長或者選定的幾個(gè)波長上跟蹤反應(yīng)的動力學(xué)過程，如果反應(yīng)非?？焖?，則使用分光光度計(jì)是必需的。對于 pNPA 的水解反應(yīng)過程，可以在 270 nm 下監(jiān)控 pNPA 的消耗或在405 nm 下監(jiān)控對-硝基苯酚的生成。然而，由于沒有監(jiān)控整個(gè)光譜范圍，有可能漏掉實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確分析所必需的重要數(shù)據(jù)。除了快速、精確的測量，精確的溫度控制對于準(zhǔn)確的動力學(xué)測量也是至關(guān)重要的。根據(jù)所研究的反應(yīng)不同，僅僅 1 °C 的變化就有可能導(dǎo)致觀測到的反應(yīng)速率發(fā)生重大變化。AgilentCary 8454 提供的帕爾貼溫度控制附件（部件號 89090A）可以精確控制溫度，能夠加熱或冷卻樣品，還能利用溫度探頭測量樣品的溫度。

實(shí)驗(yàn)部分：在堿性溶液中，pNPA 會按照下面的方程式水解為對-硝基苯酚：

從原理上講，這是一個(gè)二級反應(yīng)，但如果存在過量的水，則會表現(xiàn)出偽一級反應(yīng)動力學(xué)。反應(yīng)速率對 pH 值和溫度較為敏感。將 2.9 mL 的 0.1 M 磷酸緩沖液 (pH 8.5) 加入到比色皿中，然后將其放入恒溫的比色皿支架中使其達(dá)到平衡。樣品的精確溫度由一個(gè)外置溫度傳感器選件測定，該傳感器尺寸很小，有玻璃外罩以保持惰性。

環(huán)繞在樣品池周圍的鋁塊的溫度由帕爾貼溫度控制器控制。樣品池與鋁塊緊密接觸以盡可能減小溫度差異。預(yù)設(shè)溫度與樣品實(shí)際溫度之間只有很微小的差異。在比色皿中加入3 mL 蒸餾水，就可以用外置傳感器來測定不同溫度下二者之間的差異（圖 2）。盡管如此，監(jiān)控得到的溫度是通過外置傳感器測得的實(shí)際樣品的溫度，這就保證了最高的溫度精度。當(dāng)反應(yīng)溫度達(dá)到平衡時(shí)，將 50 µL 溶于無水乙腈的對-硝基苯基乙酸酯儲備液加入比色皿開始反應(yīng)，并用攪拌器以700 rpm 的速度混合反應(yīng)物。以時(shí)間間隔自動獲取譜圖，該時(shí)間間隔是根據(jù)反應(yīng)溫度和速度進(jìn)行調(diào)節(jié)。圖 3 顯示了 55 °C 時(shí)反應(yīng)體系的光譜，測量間隔為 125 秒。

如果在一定的波長范圍內(nèi)不斷重復(fù)記錄變化的吸收光譜，這些譜可能在一個(gè)或多個(gè)波長處發(fā)生交叉（圖 3）。這些交叉點(diǎn)稱為等消光點(diǎn)，它表示反應(yīng)物與產(chǎn)物之間發(fā)生的是單相反應(yīng)（也就是沒有副反應(yīng)或串連反應(yīng)）。圖 3 所顯示出的精確的等消光點(diǎn)表明了 Agilent Cary 8454 紫外-可見分光光度計(jì)在整個(gè)反應(yīng)時(shí)間里的光學(xué)和溫度穩(wěn)定性。

采用紫外-可見光化學(xué)工作站，您可以很容易地打開已經(jīng)收集保存的數(shù)據(jù)并在任意波長內(nèi)對數(shù)據(jù)進(jìn)行重新分析。在這個(gè)例子中，在數(shù)據(jù)采集完成后，可以提取出單波長 (405 nm)下對-硝基苯酚生成過程的數(shù)據(jù)以獲得反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)。在這個(gè)波長下，沒有其他組分的吸收（圖 4）。采用紫外-可見光化學(xué)工作站軟件中的動力學(xué)模式計(jì)算得到的 55 °C 時(shí)的偽一級速率常數(shù)為 1.24 x 10-3 s-1。這種動力學(xué)模式是生化分析附加模塊 (G1117AA) 的組成部分。

結(jié)論Agilent Cary 8454 可見-紫外光分光光度計(jì)是酶催化反應(yīng)或化學(xué)反應(yīng)動力學(xué)分析的理想工具。本文展示了帕爾貼溫度附件在反應(yīng)溫度可靠控制方面的有效性，它使得儀器在整個(gè)動力學(xué)分析期間具有穩(wěn)定性。二極管陣列分光光度計(jì)具有許多優(yōu)點(diǎn)，其全光譜采樣時(shí)間僅僅只需 0.1 秒。全光譜采集功能讓用戶能夠獲得反應(yīng)相關(guān)的所有數(shù)據(jù)。它能讓用戶在數(shù)據(jù)采集之后方便快捷地在任何波長下對反應(yīng)速率進(jìn)行處理。另一方面，通過監(jiān)控一定的波長范圍，光譜可用于多組分分析以確定在各個(gè)測量時(shí)間點(diǎn)反應(yīng)底物和產(chǎn)物的濃度。