1背景

來自于匈牙利的團(tuán)隊(duì)使用了一種創(chuàng)新的基于拉曼光譜的監(jiān)控系統(tǒng)，用于設(shè)計(jì)動(dòng)態(tài)補(bǔ)料策略，使中國倉鼠卵巢細(xì)胞(CHO)培養(yǎng)中關(guān)鍵細(xì)胞營養(yǎng)物質(zhì)維持在理想水平。針對葡萄糖、乳酸和16個(gè)單個(gè)氨基酸建立的偏最小二乘校準(zhǔn)模型具有很好的預(yù)測能力，均方根誤差值低，平方相關(guān)系數(shù)高。所開發(fā)的用于實(shí)時(shí)測量營養(yǎng)物質(zhì)和副產(chǎn)品濃度的模型，使研究人員能夠更好地了解細(xì)胞的代謝行為和營養(yǎng)物質(zhì)的消耗。

為了細(xì)胞建立更有益的營養(yǎng)環(huán)境，結(jié)合拉曼模型（葡萄糖和精氨酸）的預(yù)測，采用了兩種動(dòng)態(tài)補(bǔ)料策略來控制兩部分多組分（two-part multi-component ）培養(yǎng)基的添加。因此，營養(yǎng)物質(zhì)能（葡萄糖和氨基酸）保持在相對穩(wěn)定的水平，而不是高波動(dòng)，這為細(xì)胞提供了一個(gè)更平衡的環(huán)境。此外，與葡萄糖動(dòng)態(tài)補(bǔ)料培養(yǎng)相比，基于氨基酸的補(bǔ)料控制可以防止?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)過量，并顯著減少培養(yǎng)基的供給，具有經(jīng)濟(jì)效益。

2材料

2.1細(xì)胞系

使用表達(dá)阿達(dá)木單抗（Abbvie）的CHO-DG44細(xì)胞系進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。

2.2反應(yīng)器與條件

生物反應(yīng)器培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)在2L工作體積的Applikon玻璃生物反應(yīng)器中進(jìn)行，目標(biāo)初始密度為5×10⁵個(gè)細(xì)胞mL^-1。使用Ez控制系統(tǒng)（Applikon Biotechnology）在所需設(shè)定點(diǎn)控制以下工藝參數(shù)：攪拌速度（120 rpm）、溫度（37℃）、DO（40%）和pH（7.1）。利用BioXpert軟件，通過局域網(wǎng)連接，每10 min采集一次培養(yǎng)參數(shù)。

2.3拉曼光譜收集

在細(xì)胞培養(yǎng)過程中，使用Kaiser raman RXN2 Hybrid system收集拉曼光譜，使用不銹鋼浸沒式MR探頭通過光纖收集拉曼信號，拉曼探頭在高壓滅菌培養(yǎng)前與生物反應(yīng)器一起進(jìn)行滅菌。光譜采集范圍為200-1890cm^?1，分辨率為1cm^?1。采集的系統(tǒng)設(shè)置為75次曝光次數(shù)，曝光時(shí)間為10秒。生物反應(yīng)器覆蓋鋁箔以保護(hù)其免受光。

2.4模型處理

利用化學(xué)計(jì)量學(xué)工具分析拉曼監(jiān)測過程中生成的大型多維數(shù)據(jù)集，并提取相關(guān)的過程信息。采用PLS回歸方法，通過將拉曼光譜（作為獨(dú)立的X變量）與其對應(yīng)的離線測量參考濃度（作為因Y變量）聯(lián)系起來，建立了葡萄糖、乳酸和氨基酸組分的校準(zhǔn)模型。

2.5補(bǔ)料

在生物反應(yīng)器中添加補(bǔ)料溶液以補(bǔ)充細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)：兩部分多組分補(bǔ)料培養(yǎng)基（ActiCHO Feed A and Feed B，GE Healthcare）和400 g L^-1葡萄糖（Sigma-Aldrich）原液。

2.6兩種補(bǔ)料策略

采用兩種基于葡萄糖和精氨酸的動(dòng)態(tài)補(bǔ)料策略，使細(xì)胞的營養(yǎng)物質(zhì)保持在所需的濃度。在以葡萄糖為基礎(chǔ)的動(dòng)態(tài)補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中，基于拉曼監(jiān)測的葡萄糖濃度（GLC）來控制營養(yǎng)補(bǔ)充。如果GLC低于11 mM的設(shè)定值，則使用兩部分多組分補(bǔ)料培養(yǎng)基（Feed A和Feed B）進(jìn)行補(bǔ)料，以將葡萄糖限制在11 mM的低水平。除此之外，不需要額外的葡萄糖。因此，雙組分飼料培養(yǎng)基中所含的所有營養(yǎng)成分都按指示劑葡萄糖的比例添加。

在基于氨基酸的動(dòng)態(tài)補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中，補(bǔ)料策略是基于拉曼監(jiān)測的GLC和精氨酸濃度（ARG）調(diào)整三種料液的補(bǔ)加（Feed A和Feed B和單獨(dú)的葡萄糖原液）。目的是將ARG水平維持在2.5 mM的設(shè)定值，同時(shí)將葡萄糖限制在11 mM的低水平。

2.7PLS模型

圖1：PLS模型用于校準(zhǔn)（灰色圓圈）和驗(yàn)證點(diǎn)（紅色菱形）輸出的預(yù)測與測量的葡萄糖(A)和乳酸(B)濃度值的圖

為了研究拉曼模型的預(yù)測性能，研究人員采用了一個(gè)獨(dú)立的生物反應(yīng)器培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)作為驗(yàn)證運(yùn)行。圖1A和B顯示了離線測量的葡萄糖和乳酸濃度與拉曼預(yù)測濃度，其中灰色圓圈為校準(zhǔn)，紅色菱形為驗(yàn)證樣品。兩種拉曼模型都能準(zhǔn)確估計(jì)葡萄糖和乳酸的低RMSEP值分別為1.64和4.51 mM，高r2值分別為0.986和0.998，效果較為理想。

圖2：在PLS回歸過程中，拉曼預(yù)測和離線測量數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性：丙氨酸(A)、精氨酸(B)、苯丙氨酸(C)和纈氨酸(D)。校準(zhǔn)數(shù)據(jù)集用灰色圓圈表示，測試數(shù)據(jù)集用紅色菱形表示

表2：20種氨基酸成分構(gòu)建的偏最小二乘模型的性能(用于校準(zhǔn)、交叉驗(yàn)證和預(yù)測)

研究人員建立了ALA、ARG、ASP、ILE、LEU、PHE、GLU、THR、VAL和LYS的最佳模型，其中平均RMSEC和RMSECV誤差值分別為用于校準(zhǔn)的濃度范圍平均值的8 ± 1%和10 ± 1%。這些PLS模型的一些預(yù)測能力的例子如圖2A-D所示?？梢钥吹剑瑪?shù)據(jù)點(diǎn)（灰色圓圈）圍繞著理想的1：1線，這意味著模型提供的拉曼預(yù)測接近參考濃度測量值。

3結(jié)果

葡萄糖的動(dòng)態(tài)補(bǔ)料：基于拉曼監(jiān)測GLC水平自動(dòng)控制多組分補(bǔ)料培養(yǎng)基（補(bǔ)料A和補(bǔ)料B）

拉曼的過程控制在培養(yǎng)第4天（第93小時(shí)）前不久開始。此后，通過連續(xù)添加補(bǔ)料A（補(bǔ)料B培養(yǎng)基為補(bǔ)料A體積的1/10），將GLC保持在所需的低水平（11 mM），持續(xù)4天。在整個(gè)生物反應(yīng)器運(yùn)行過程中，為細(xì)胞總共補(bǔ)加了大約240 mL的補(bǔ)料A和24 mL的補(bǔ)料B。然而，由于使用多組分補(bǔ)料培養(yǎng)基將GLC調(diào)整到所需的水平，所有其他組分都根據(jù)兩種培養(yǎng)基的化學(xué)計(jì)量組成按葡萄糖比例供應(yīng)。這種方法的主要缺點(diǎn)是可能會過度補(bǔ)料其他營養(yǎng)物質(zhì)。

基于氨基酸的動(dòng)態(tài)補(bǔ)料培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)：ARG(A)和GLC (B)的拉曼在線監(jiān)測和營養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)料的自動(dòng)控制。多組分補(bǔ)料培養(yǎng)基（補(bǔ)料A和補(bǔ)料B）的添加，同時(shí)提供濃縮葡萄糖原液以避免葡萄糖耗盡。

其目標(biāo)是將葡萄糖和額外的關(guān)鍵營養(yǎng)物質(zhì)保持在一個(gè)可接受的濃度范圍內(nèi)，從而確保細(xì)胞處于一個(gè)平衡的培養(yǎng)環(huán)境。ARG和GLC的設(shè)定點(diǎn)分別為2.5mM和11 mM。此外，研究人員還設(shè)定了一個(gè)葡萄糖的上限（15 mM），以避免過量，因?yàn)檠a(bǔ)料A培養(yǎng)基中含有500 mM的葡萄糖。

在實(shí)驗(yàn)后期，觀察到ARG模型預(yù)測的誤差略有增加（圖4A）。因此，ARG保持在低于期望的2.5 mM的較低水平，這表明未來需要進(jìn)一步的模型優(yōu)化。相比之下，GLC在目標(biāo)點(diǎn)11 mM左右（在9到13mM之間）發(fā)生變化（圖4B）。比較提供的多組分飼料培養(yǎng)基的累積體積，在氨基酸動(dòng)態(tài)補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)中，分別補(bǔ)加了100 mL Feed A和10 mL Feed B，不到葡萄糖動(dòng)態(tài)補(bǔ)料實(shí)驗(yàn)的一半。此外，當(dāng)所提供的補(bǔ)料A培養(yǎng)基不能將GLC水平提高到11 mM時(shí)，向反應(yīng)器中添加單獨(dú)的葡萄糖原液（2220 mM）。在整個(gè)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，添加37 mL葡萄糖原液和100 mL補(bǔ)料A培養(yǎng)基后，總共需要132 mmol葡萄糖來維持所需的GLC水平。因此，側(cè)面證明了當(dāng)使用基于葡萄糖的補(bǔ)料策略調(diào)整添加培養(yǎng)基時(shí)，部分營養(yǎng)物質(zhì)存在過量添加的情況。

4結(jié)論

兩種動(dòng)態(tài)補(bǔ)料培養(yǎng)的細(xì)胞密度(A)、活力(B)和產(chǎn)物滴度(C)

基于拉曼技術(shù)開發(fā)的兩種控制策略，很好地完成了對目標(biāo)參數(shù)的監(jiān)控和閉環(huán)補(bǔ)料控制。其中，采用基于葡萄糖的動(dòng)態(tài)飼養(yǎng)策略，可以將葡萄糖濃度限制在一個(gè)恒定的低水平，但補(bǔ)料培養(yǎng)基中的其他營養(yǎng)物質(zhì)含量在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)會過量并積累。相比之下，新開發(fā)的精氨酸補(bǔ)料策略可以有效地將氨基酸和葡萄糖的濃度控制在一個(gè)狹窄的范圍內(nèi)，從而為細(xì)胞建立一個(gè)更穩(wěn)定的生長環(huán)境。比較兩種補(bǔ)料策略對培養(yǎng)性能的影響，兩種策略在細(xì)胞密度、活力和產(chǎn)生的抗體濃度方面的結(jié)果相似。但是，與基于葡萄糖的動(dòng)態(tài)補(bǔ)料策略相比，基于精氨酸的動(dòng)態(tài)補(bǔ)料策略可以顯著減少（一半以上）添加的累積量，減少了培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基的使用量，提高了生產(chǎn)效率。

Domján, J., Pantea, E., Gyürkés, M., Madarász, L., Kozák, D., Farkas, A., Horváth, B., Benk?, Z., Nagy, Z.K., Marosi, G. & Hirsch, E. 2022, "Real‐time amino acid and glucose monitoring system for the automatic control of nutrient feeding in CHO cell culture using Raman spectroscopy", Biotechnology journal, vol. 17, no. 5, pp. e2100395-n/a.