熒光分光光度計(jì)是屬于分光光度計(jì)的一種，在生物化學(xué)、生物醫(yī)學(xué)、環(huán)境化工等部門的應(yīng)用較為廣泛，熒光分光光度計(jì)是對(duì)經(jīng)光源激發(fā)后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)或經(jīng)化學(xué)處理后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)成份分析的儀器物質(zhì)熒光的產(chǎn)生是由在通常狀況下處于基態(tài)的物質(zhì)分子吸收激發(fā)光后變?yōu)榧ぐl(fā)態(tài), 這些處于激發(fā)態(tài)的分子是不穩(wěn)定的，在返回基態(tài)的過(guò)程中將一部分的能量又以光的形式放出，從而產(chǎn)生熒光．不同物質(zhì)由于分子結(jié)構(gòu)的不同,其激發(fā)態(tài)能級(jí)的分布具有各自不同的特征，這種特征反映在熒光上表現(xiàn)為各種物質(zhì)都有其特征熒光激發(fā)和發(fā)射光譜。熒光分光光度計(jì)的工作原理就是根據(jù)這一現(xiàn)象設(shè)計(jì)的，是由高壓汞燈或氙燈發(fā)出的紫外光和藍(lán)紫光經(jīng)濾光片照射到樣品池中，激發(fā)樣品中的熒光物質(zhì)發(fā)出熒光，熒光經(jīng)過(guò)濾過(guò)和反射后，被光電倍增管所接受，然后以圖或數(shù)字的形式顯示出來(lái)。

二、熒光分光光度計(jì)構(gòu)成

隨著科技的進(jìn)步帶動(dòng)著生產(chǎn)工藝技術(shù)的提升熒光分光光度計(jì)的從手控式熒光分光光度計(jì)發(fā)展到自動(dòng)記錄式熒光分光光度計(jì)以及現(xiàn)在的計(jì)算機(jī)控制式熒光分光光度計(jì)都是有以下幾部分組成。

1、光源

一般是為高壓汞蒸氣燈或氙弧燈，后者能發(fā)射出強(qiáng)度較大的連續(xù)光譜，且在300nm～400nm 范圍內(nèi)強(qiáng)度幾乎相等，所以更為常用。

2、激發(fā)單色器

作為篩選特定的激發(fā)光譜器是置于光源和樣品室之間，也稱喂單色器。

3、發(fā)射單色器

作為篩選特定的發(fā)射光譜器也成為第二單色器，是至于置于樣品室和檢測(cè)器之間。常采用光柵為單色器

4、樣品室

用于盛放樣品的空間，通常由石英池(液體樣品用)或固體樣品架(粉末或片狀樣品)組成。樣品不同時(shí)光源與檢測(cè)器的角度有所不同，測(cè)量固體樣品是直角，測(cè)量液體樣品時(shí)銳角。

5、檢測(cè)器

作為光信號(hào)放大的同時(shí)還是將光信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。一般是用光電管或光電倍增管作檢測(cè)器。

三、熒光分光光度計(jì)使用方法

（一）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備工作

1、實(shí)驗(yàn)所需樣品若是液體時(shí)，要檢查濃度范圍是否合適，是否需要稀釋，以及所需要的溶劑類型以及稀釋倍數(shù)。

2、實(shí)驗(yàn)所需樣品若是固體時(shí)，要產(chǎn)看是否為均勻粉末、片狀、是否可直接測(cè)定等。

3、檢查電源電壓是否符合設(shè)備要求，以及接地設(shè)施是否連接。

4、查看環(huán)境是否符合設(shè)備工作所需環(huán)境要求，環(huán)境溫度應(yīng)在20℃±5℃;相對(duì)濕度不大于70%;電源穩(wěn)定，無(wú)磁場(chǎng)、電場(chǎng)干擾。

5、測(cè)試前設(shè)備要進(jìn)行預(yù)熱

（二）操作步驟

1、在之前的準(zhǔn)備工作完成后，接通電源，然后打開主機(jī)開關(guān)[much]后打開光源開關(guān)。

注意：要根據(jù)使用說(shuō)明來(lái)啟動(dòng)計(jì)算機(jī)。并且要進(jìn)行預(yù)熱。

2、預(yù)熱完成夠，按照說(shuō)明查看是否需要對(duì)設(shè)備進(jìn)行校準(zhǔn)。

注意：儀器一般是在20天內(nèi)必須從新進(jìn)行一次激發(fā)校準(zhǔn)和發(fā)射校準(zhǔn)

3、.基本測(cè)定

①熒光激發(fā)光譜測(cè)定

設(shè)置儀器參數(shù)，掃描發(fā)射波長(zhǎng)，找到max λ ex、max λ em，以此為發(fā)射波長(zhǎng)，記錄發(fā)射強(qiáng)度作為激發(fā)波長(zhǎng)的函數(shù)，便得到激發(fā)光譜。

②熒光發(fā)射光譜測(cè)定

設(shè)置儀器參數(shù)，掃描激發(fā)波長(zhǎng)，找到max λ ex、max λ em，以此為激發(fā)波長(zhǎng)，記錄發(fā)射強(qiáng)度與發(fā)射波長(zhǎng)間的函數(shù)關(guān)系，便得到熒光發(fā)射光譜。

③差譜測(cè)定

設(shè)置儀器參數(shù)，選擇合適的工作方式，測(cè)定背景溶液的發(fā)射光譜并儲(chǔ)存起來(lái)，在一定的工作方式下，掃描樣品溶液的發(fā)射波長(zhǎng)，得到當(dāng)時(shí)的光度值和儲(chǔ)存的背景值之間的差示值，即差譜。

④峰面積積分

選擇適當(dāng)?shù)墓ぷ鞣绞?，?duì)樣品溶液進(jìn)行積分操作，即得到峰面積積分。

⑤熒光強(qiáng)度

選擇合適的測(cè)量參數(shù)，設(shè)置λ ex、λ em，采用定點(diǎn)讀數(shù)或掃描方式，即可測(cè)得所選波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度。

⑥定量測(cè)定

配制一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定的測(cè)定條件下，設(shè)置λ ex、λ em，按照由稀至濃的次序，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，繪制熒光強(qiáng)度濃度的工作曲線，不改變儀器參數(shù)測(cè)定未知溶液的熒光強(qiáng)度，由工作曲線即可求出未知溶液的濃度。

4、分析結(jié)果

①熒光激發(fā)光譜、發(fā)射光譜以及其他光譜由儀器控制電腦直接繪出。

②峰面積積分、熒光強(qiáng)度由儀器控制電腦計(jì)算顯示。

③定量測(cè)試：在相同的測(cè)定條件下，測(cè)定一系列已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液的熒光強(qiáng)度，繪制出熒光強(qiáng)度-濃度的工作曲線。濃度未知的溶液的熒光強(qiáng)度測(cè)定后，由工作曲線求出該溶液的濃度。

四、熒光粉光光度計(jì)使用注意事項(xiàng)

（一）日常注意事項(xiàng)

1、開機(jī)時(shí)，請(qǐng)先開氙燈電源，再開主機(jī)電源。注意開機(jī)順序。

2、每次開機(jī)后請(qǐng)先確認(rèn)兩邊排熱風(fēng)扇是否工作正常如發(fā)現(xiàn)風(fēng)扇有故障，應(yīng)停機(jī)檢查。

3、主機(jī)工作時(shí)頂部排熱器溫度很高，切勿觸摸以免受傷。

4、請(qǐng)盡量減少不必要的氙燈觸發(fā)次數(shù)，避免氙燈在高壓下反復(fù)觸發(fā)。關(guān)閉氙燈電源后，若要重新使用，請(qǐng)等待60秒以后重新觸發(fā)。

5、運(yùn)行未知濃度的樣品測(cè)試時(shí)，靈敏度設(shè)置請(qǐng)從低位向高圍( 0-7)逐步設(shè)置。

6、當(dāng)操作者錯(cuò)誤操作或其他干擾引起微機(jī)錯(cuò)誤時(shí)，應(yīng)該立即關(guān)斷主機(jī)電源重新啟動(dòng)，但無(wú)須關(guān)斷氙燈電源。

7、單色器內(nèi)用螺絲緊固處不得松動(dòng)。

（二）其他注意事項(xiàng)

1、所需溶液要是已經(jīng)配置好要查看在低溫冰箱里的存放的時(shí)間是否超過(guò)一星期，如果已超過(guò)則需從新配置。

2、實(shí)驗(yàn)所用的樣品池是四面透光的石英池，拿取的時(shí)候用手指掐住池體的上角部，不能接觸到四個(gè)面，清洗樣品池后應(yīng)用擦鏡紙對(duì)其四個(gè)面進(jìn)行輕輕擦拭。

3、在測(cè)試樣品時(shí)，注意熒光強(qiáng)度范圍的設(shè)定不要太高，以免測(cè)得的熒光強(qiáng)度超過(guò)儀器的測(cè)定上限。

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)束后及時(shí)的清理臺(tái)面，處理廢液，清洗和放置好樣品池，將下次要用的溶液放回冰箱。

5、清潔儀器外表時(shí)請(qǐng)勿使用乙醇等有機(jī)溶劑，請(qǐng)勿在工作中清潔。不使用時(shí)請(qǐng)加防塵罩要保持比色皿的清潔。

五、熒光分光光度計(jì)選購(gòu)指南

1、首先要考慮品牌以及代理商信譽(yù)以及售后服務(wù)，不僅關(guān)系到儀器的質(zhì)量穩(wěn)定性，還關(guān)系到以后的維修服務(wù)。

2、然后要關(guān)注儀器的狹縫(光譜帶寬)，狹縫還決定了儀器的分辨率，良好的分辨率可以分辨間隔很小的波峰。

3、儀器的信噪比是一項(xiàng)非常重要的參數(shù)，它一定程度上反映儀器的檢出能力。

4、波長(zhǎng)[accuracy]度和重復(fù)性也是一項(xiàng)比較重要的指標(biāo)。

5、掃描速度雖然也很重要，但這和需求有關(guān)系，如果對(duì)時(shí)間沒(méi)有太多的要求，可以不必在意。

6、綜合以上進(jìn)行對(duì)比選購(gòu)性價(jià)比較為高的。

六、熒光分光光度計(jì)與其他分光光度計(jì)不同點(diǎn)

相同點(diǎn)：比色皿、檢測(cè)器、記錄儀這些基本一樣

不同點(diǎn)：光源，是否需要色劑

紫外、可見分光光度計(jì)在紫外區(qū)使用氫燈或氘燈，在可見光區(qū)使用氘燈或溴鎢燈。它們發(fā)出的都是連續(xù)光譜，通過(guò)三棱鏡（中檔）、光柵（高檔）、濾光片（低級(jí)）等分光，這樣兩種燈組合基本涵蓋了紫外-可見光的波長(zhǎng)范圍。

熒光分光光度計(jì)由氙弧燈發(fā)出的光通過(guò)切光器使其變成斷續(xù)之光以及激發(fā)光單色器變成單色光后，此光即為熒光物質(zhì)的激發(fā)光，被測(cè)的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過(guò)單色器變成單色熒光后照射于測(cè)樣品用的光電倍增管上。

紫外-可見分光光度計(jì)可用于大部分有色物質(zhì)的定量監(jiān)測(cè)，通常需要使用各種各樣的顯色劑。熒光分光光度計(jì)可用于測(cè)試發(fā)光材料的發(fā)射光譜＼激發(fā)光譜＼時(shí)間掃描，不需要顯色劑。