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導(dǎo)讀

代謝組學(xué)分析，尤其是非靶向代謝組學(xué)樣品分析對儀器、方法有極高的要求：色譜分離、質(zhì)譜檢測需要盡可能覆蓋未知化合物，組學(xué)樣品又存在樣品珍貴、總分析時(shí)間長、樣品基質(zhì)復(fù)雜、對質(zhì)譜負(fù)荷較重等問題；因此如何在最短的分析時(shí)間內(nèi)，消耗最少的樣品，覆蓋盡可能多的未知物，對質(zhì)譜端產(chǎn)生最小的污染負(fù)荷并維持?jǐn)?shù)據(jù)穩(wěn)定性，是非靶向代謝組學(xué)分析一直面臨的挑戰(zhàn)。

島津4in1技術(shù)方案：全譜二維+高分辨質(zhì)譜或三重四極桿質(zhì)譜

島津4in1技術(shù)方案，通過全譜二維寬極性分離+LCMS-9050的正負(fù)極同時(shí)掃描功能，相比常規(guī)液質(zhì)分析方法，可以節(jié)省3/4的樣品和總分析時(shí)間，減少質(zhì)譜3/4的分析負(fù)擔(dān)，并通過平行設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)充分平衡和清洗，減少了交叉污染和記憶效應(yīng)，提高了系統(tǒng)穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。利用4in1技術(shù)方案，島津與雜交水稻全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測中心合作開展不同口感黑米非靶向代謝組學(xué)研究，結(jié)果優(yōu)異，一起來看看吧！

代謝組學(xué)包含非靶向和靶向代謝組學(xué)，前者對不同組別樣品中的未知目標(biāo)物或全組分進(jìn)行分析，后者針對已知目標(biāo)物進(jìn)行分析檢測，兩者最終目的均是通過對比不同組別樣品中的成分差異，通過統(tǒng)計(jì)分析得到具體差異代謝物，從而指導(dǎo)、分析、解讀組別差異的因果、機(jī)理并展開差異物的實(shí)際篩查應(yīng)用。目前的通用分析配置是：液相色譜作為前端分離系統(tǒng)，高分辨質(zhì)譜或三重四極桿質(zhì)譜作為檢測器（前者用于非靶向，后者用于靶向）。

非靶向代謝組學(xué)分析的三大難點(diǎn)

代謝組學(xué)分析對色、質(zhì)譜的分離檢測能力、軟件數(shù)據(jù)里處理和統(tǒng)計(jì)分析功能、應(yīng)用人員方法設(shè)置等均有較高的門檻和要求，而非靶向代謝組學(xué)還有以下幾個(gè)特殊需求，增加了分析難度：

01對液相色譜的分析要求：

因非靶向代謝組學(xué)面對的是完全未知的目標(biāo)物，其極性范圍、化合物數(shù)量、分離條件等均無法預(yù)設(shè)，因此無法使用單一色譜柱，如反相色譜柱或親水色譜柱做分離；

02對質(zhì)譜端的分析要求：

同樣因?yàn)槟繕?biāo)物完全未知，無法判斷目標(biāo)物的電離能力，因此正離子和負(fù)離子必須都要掃描檢測；

03樣品特殊性：

樣品通常較珍貴，如動(dòng)物組織樣品、細(xì)胞樣品、血液樣品等，因此要求樣品消耗量/進(jìn)樣量盡可能少；樣品數(shù)量多，通常有2-5組樣品，每組樣品數(shù)必須大于6個(gè)，因此總分析時(shí)間長，如果樣品分析循環(huán)次數(shù)增加，則總分析時(shí)間更為成倍增加；樣品基質(zhì)復(fù)雜，對質(zhì)譜污染負(fù)擔(dān)較大。樣品特殊性在非靶向和靶向樣品都存在。

基于以上原因，如何在最短的分析時(shí)間內(nèi)，消耗最少的樣品，覆蓋盡可能多的未知物，對質(zhì)譜端產(chǎn)生最小的污染負(fù)荷并維持?jǐn)?shù)據(jù)穩(wěn)定性，是非靶向代謝組學(xué)分析一直面臨的挑戰(zhàn)。

島津4in1代謝組學(xué)技術(shù)方案

兩大硬件部分

為了解決以上非靶向代謝組學(xué)三方面的難點(diǎn)，島津推出了4in1代謝組學(xué)技術(shù)方案。該方案硬件組成分為兩部分：

前端系統(tǒng)為全譜二維液相系統(tǒng)。該系統(tǒng)基于兩個(gè)授權(quán)發(fā)明專利：極性分流技術(shù)、在線稀釋技術(shù)，是島津獨(dú)家產(chǎn)品，適合于未知物和全組分分析，可作為寬極性多目標(biāo)物數(shù)據(jù)庫的通用分離平臺(tái)，并適用于極限相差較大的兩類關(guān)聯(lián)物質(zhì)的同時(shí)分析，而且該系統(tǒng)內(nèi)含一個(gè)UHPLC子系統(tǒng)，方便日常常規(guī)檢測；而且該系統(tǒng)具有平行設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)1D和2D的充分平衡和清洗，減少了交叉污染和記憶效應(yīng)，提高了系統(tǒng)穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

全譜二維液相系統(tǒng)

質(zhì)譜端為LCMS-9050高分辨質(zhì)譜（非靶向）或三重四極桿系列產(chǎn)品（靶向）。LCMS-9050是島津最新推出的新一代高分辨QTOF。這一款高分辨四極桿-飛行時(shí)間液質(zhì)聯(lián)用儀傳承了島津LCMS-9030的優(yōu)秀設(shè)計(jì)，依然保持準(zhǔn)確度高，穩(wěn)定性好，靈敏度高、高分辨率的卓越性能。相對于其他品牌Q-TOF，其優(yōu)勢是極性切換時(shí)間大大縮短，最大采集速度提升至200Hz，可在同一時(shí)段進(jìn)行正負(fù)離子同時(shí)掃描，完成普通Q-TOF需要兩次進(jìn)樣才能完成的工作。

方案優(yōu)勢

基于以上兩個(gè)技術(shù)，組合成為島津4in1技術(shù)方案。對于普通色譜系統(tǒng)，為了覆蓋高低極性化合物，需要分別用HILIC和RPLC進(jìn)行分離；為了完成未知物正負(fù)離子掃描，需要各進(jìn)一針完成正離子和負(fù)離子分析，而島津4in1方案=全譜二維+LCMS-9050，具有以下兩方面優(yōu)勢：

（1）通過寬極性分離+正負(fù)極同時(shí)掃描，實(shí)現(xiàn)4in1分析模式，從而節(jié)省3/4的樣品和總分析時(shí)間，并減少質(zhì)譜3/4的分析負(fù)擔(dān)；

（2）通過平行設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)1D和2D的充分平衡和清洗，減少了交叉污染和記憶效應(yīng)，提高了系統(tǒng)穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。

島津4in1一針分析=普通系統(tǒng)4針分析

案例分享-不同口感黑米非靶向代謝組學(xué)研究

雜交水稻全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測中心

雜交水稻全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室是國家首批批復(fù)建設(shè)的20家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室之一，其檢驗(yàn)檢測中心的分子檢測與品質(zhì)安全兩項(xiàng)工作在雜交水稻科技創(chuàng)新中起到了關(guān)鍵支撐作用，為雜交水稻的高質(zhì)量發(fā)展保駕護(hù)航。島津與雜交水稻全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測中心合作，利用4in1技術(shù)方案，嘗試不同個(gè)口感黑米非靶向代謝組學(xué)研究，取得優(yōu)異成果，并由此促成成立了“雜交水稻全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測中心-島津合作實(shí)驗(yàn)室”。

島津企業(yè)管理(中國)有限公司分析計(jì)測事業(yè)部營業(yè)部副部長朱精華（左）與雜交水稻全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行主任孫傳清（右）為合作實(shí)驗(yàn)室揭牌

利用4in1方案分析雜交水稻全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測中心提供的30個(gè)不同口感黑米，并混合制作了一個(gè)QC樣品。為了評估、校準(zhǔn)系統(tǒng)穩(wěn)定性，在批處理過程中加入10針QC樣品分析，進(jìn)樣序號分別是1-4號，20號，36-40號，時(shí)間跨度26小時(shí)。最后將正負(fù)離子同事采集的10個(gè)QC樣品的TIC圖做疊加展示，可見數(shù)據(jù)重現(xiàn)性非常*；另外，在樣品中添加兩個(gè)內(nèi)標(biāo)，一個(gè)為高極性正離子響應(yīng)，一個(gè)為低極性負(fù)離子響應(yīng)，并提取計(jì)算10個(gè)QC樣品中這兩個(gè)內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量穩(wěn)定性，結(jié)果兩個(gè)內(nèi)標(biāo)質(zhì)量偏差均小于0.85ppm，結(jié)果理想，符合4in1分析的預(yù)期。

基于穩(wěn)定的色、質(zhì)譜表現(xiàn)，通過統(tǒng)計(jì)分析得到了優(yōu)異的代謝組學(xué)分析結(jié)果：正離子模式共檢測到代謝特征峰11780個(gè)，負(fù)離子模式共檢測到代謝特征峰13637個(gè)；統(tǒng)計(jì)分析顯示組內(nèi)相對聚集，組間區(qū)分明顯，滿足后續(xù)代謝組學(xué)分析要求；最后通過分組PLS-DA分析及置換驗(yàn)證模型驗(yàn)證，兩兩對比（好口感黑米vs差口感黑米）得到1473個(gè)差異代謝物，并通過數(shù)據(jù)庫鑒定了其中767個(gè)差異物，包含了脂肪?；?、黃酮類、氨基酸、萜類、芳香族、苯類等物質(zhì)。

10針QC樣品TIC重疊圖

10針QC樣品中內(nèi)標(biāo)質(zhì)量數(shù)偏差

分析對比篩選出大量差異代謝物 （其中BMZ、SB為口感好黑米、YHM、HH為口感差黑米）

結(jié)語

為了解決非靶向代謝組學(xué)難點(diǎn)，島津推出了4in1代謝組學(xué)技術(shù)方案：通過全譜二維寬極性分離+LCMS-9050的正負(fù)極同時(shí)掃描功能，可以節(jié)省3/4的樣品和總分析時(shí)間，減少質(zhì)譜3/4的分析負(fù)擔(dān)；另外，系統(tǒng)采用了1D和2D的平行設(shè)計(jì)，實(shí)現(xiàn)了充分平衡和清洗，減少了交叉污染和記憶效應(yīng)，提高了系統(tǒng)穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。將該方案應(yīng)用于不同口感黑米非靶向代謝組學(xué)研究，數(shù)據(jù)優(yōu)異，結(jié)果可靠，獲得了合作方雜交水稻全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)檢測中心的高度肯定！

 撰稿人：鐘啟升

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